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玉米籽粒突变体的表型分析和基因定位(2)

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1.2 实验方法

1.2.1 扫描电镜观察淀粉粒结构取 M4代分离果穗上的野生型和突变体籽粒, 在 65℃烘箱内连续烘 48 h确保籽粒完全脱水干燥, 把胚乳部分敲碎,固定在贴有导电条的圆形金属样品台上, 置于离子溅射仪中镀金膜, 用HITACHISU8020扫描电镜对突变体胚乳的淀粉大小和结构变化进行观察。

1.2.2 石蜡切片取授粉后12 d的M4代分离果穗上的突变体和野生型籽粒, 用 FAA固定液保存,固定后的组织材料进行脱水、透明、浸蜡与包埋, 将包埋好的蜡块切片黏附于载玻片上, 然后盖上盖玻片在45℃烘箱里干燥。再用OLYMPLUS BX53正置显微镜(奥林巴斯, 日本)观察并照相。

1.2.3 籽粒蛋白、油分和淀粉含量的测定淀粉含量的测定: 取野生型籽粒和突变体籽粒在 65℃烘箱中烘6 h以上, 用磨样机磨样, 称取2.5 g粉末, 加10 mL CaCl2-乙酸溶液润湿, 再加50 mL CaCl2溶液充分混匀, 置于120℃油浴锅中加热30 min, 放入冷水槽冷却至室温, 将水解液全部加入带漏斗100 mL容量瓶中, 并加1 mL硫酸锌溶液摇匀, 在加1 mL硫酸亚铁溶液充分沉淀蛋白质, 蒸馏水定容至100 mL, 摇匀过滤。用空白液调整旋光仪零点, 再将滤液装满旋光仪室温下测定。结果计算:

粗淀粉(%) = α×105/L × W × (100 ? H) × 203。

式中, α为旋光仪上读出的旋转角度; L为炫光管长度(dm); W为样品重(g); 203为淀粉比旋度; H为样品含水量(%)。

籽粒蛋白和油分测定: 用德国 BRUKER MPA近红外光谱仪测定油分和蛋白含量, 分别选取大小均一的突变体和野生型籽粒置于样品杯中, 用透射方式扫描获得籽粒近红外样品的吸收光谱图, 每个样品重复装样扫描3次, 实验设置3个生物学重复。根据本实验室已构建的蛋白和油分模型, 利用BRUKER公司的OPUS软件进行数据分析。

1.2.4 基因的初定位和精细定位以突变体与Mo17杂交构建的 F2群体为材料开展基因定位。提取F2果穗上的45粒突变籽粒及双亲的基因组DNA。委托博瑞迪生物技术有限公司进行基于 20K GBTS(genotyping by target sequencing) 靶向测序基因型分型[3]。计算每个多态性 SNP标记的基因型频率(SNP index), 即亲本型基因型占所有F2样本基因型的频率, SNP index越接近1, 表明标记与目标基因连锁越紧密。然后用MaizeGDB和Gramene等网站比对和下载定位区间内的核苷酸序列, 用 Primer 5等软件开发InDel和SNP标记。进一步扩大定位群体, 筛选标记处的交换单株, 完成基因精细定位。

利用试剂盒 DP360 (天根生化科技(北京)有限公司)提取正常籽粒和突变籽粒的DNA, 操作步骤如下:样品充分研磨, 加入裂解液, 涡旋离心, 转移上清过柱, 将滤液和无水乙醇等体积混合, 将混合液过柱,倒掉滤液, 加漂洗液漂洗2次, 离心, 加ddH2O溶解2 min, 得到的DNA溶液置于–20℃保存。选用25 μL扩增体系, 上下游引物各1.25 μL, PCR mix 12.5 μL,DNA 2 μL, ddH2O 8 μL。扩增程序为: 98℃预变性3 min; 98℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸30 s、共35个循环; 72℃终延伸5 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 结果与分析

2.1 小粒突变体smk7的表型分析

smk7是玉米自交系 B73经 EMS诱变产生的小籽粒突变体。对 M4和 F2代成熟分离果穗进行观察发现,smk7突变体与野生型相比, 种皮皱缩,籽粒扁小, 胚与胚乳发育缺陷(图 1-A, B)。仅有10%的突变籽粒可以发育成苗, 但幼苗植株生长发育缓慢, 叶色浅黄, 最终不能发育为正常植株(图 1-C)。百粒重测量结果表明, 突变体籽粒百粒重显著降低, 仅约野生型籽粒的 35% (图 2)。对smk7和野生型籽粒胚乳结构进行扫描电镜观察发现, 野生型淀粉粒呈球形, 形状规则, 而突变体淀粉粒变小, 结构不规则。突变体与野生型蛋白体结构无明显差异(图3)。

表1 基因定位引物序列Table 1 Primer sequences for gene mapping used in the study引物Primer正向序列Forward sequence (5′–3′)反向序列Reverse sequence (5′–3′)In4.3 AACGCATCATCCTATGTCCAAC GGGTGAAGCCAGCCATTATTT In1.9 ATGGTACGATCAACATAAAGGGAA GGCGTCACCGAAGAAATACAC In0.83 GCAAGAAGCACCAGCCCT CGAGCGAAAGAAAGGAATGT In1.16 ACATGACCCACGATCCAGACA TGCAGCCACTCTCCTTATGGT SNP1 TTAGGGTGGAGTTGCTTCGC TTATGAATGAAGCACGGAAATGA SNP2 TTAGGGTGGAGTTGCTTCGC TTATGAATGAAGCACGGAAATGA SNP3 AAGGAATGGAGGCTTGGGTT ACAGCCGCCTTCGGATTC SNP4 AGCGGTCCTTGACTTTATTTGA CATTACACGACCAATACAGCCA SNP5 TGGCTTTTCATACCCTCCTCC CCTTCGCTGTGACTTGGATGT

图1smk7突变体表型Fig. 1 Morphological phenotypes of thesmk7A: M4代果穗; B:smk7与野生型籽粒表型比较; C:smk7和野生型幼苗表型比较。A: maize ear of M4generation, B: comparison of the phenotype betweensmk7and WT kernels; C: comparison of the phenotype betweensmk7and WT seedlings.

文章来源：《玉米科学》网址: http://www.ymkxzz.cn/qikandaodu/2021/0226/765.html