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玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方(2)

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2.2 抗原最佳包被条件的确定

包被条件结果见图1。在相同温度下，包被时间过短会因抗原包被量少导致P/N值降低；包被时间过长则N值变大从而导致P/N值降低。结果表明，4 ℃ 12 h 时P/N值最大，因此抗原最佳包被条件为4 ℃包被12 h。

图1 最佳包被条件优化Fig.1 Optimization of coating condition

2.3 酶标二抗稀释倍数的确定

在ic-ELISA检测中，单克隆抗体与酶标二抗结合至关重要，稀释倍数大，可节约二抗，但稀释倍数过大会导致底物显色不完全。将0.4 mg/L HRP-山羊抗小鼠IgG分别稀释2 000、3 000、4 000、5 000、6 000倍，做ic-ELISA。由图2可知，3 000倍稀释时P/N值较高，故选择3 000倍作为酶标二抗最佳稀释倍数。

图2 酶标二抗工作质量浓度的优化Fig.2 Optimization of IgG-HRP working concentrations

2.4 底物作用时间的确定

对底物作用时间进行测定，结果如图3。随着底物作用时间增加，P/N值逐渐增加后趋于平稳，但底物作用时间过长时，P/N值下降。综合反应时间和P/N值，选择15 min作为合适的底物作用时间。

图3 底物最佳作用时间的优化Fig.3 Optimization of reaction time of substrate

2.5 标准曲线的建立

按1.2.2中的方法绘制抑制曲线，结果见图4。线性回归方程为：y=，R2=0.973 6。线性范围(抑制率20%～80%)为 1.41～54.2 mg/L，最低检测限(抑制率10%)为 24.5 μg/kg。

图4 标准曲线的建立Fig.4 Establishment of standard curve

2.6 特异性

取真菌毒素FB1、FB2、DON、ZEA、T-2、AFB1，按照已经优化好的ic-ELISA条件进行检测，结果见表2。FB1与FB2交叉反应率为129.88%，与DON、ZEA、T-2、AFB1的交叉反应率均小于10%。

表2 交叉反应率的测定Table 2 The determination of the cross-reactivity加标物IC50/(μg·L-1)交叉反应率/%.884DON>1 000<10ZEA>1 000<10T-2>1 000<10AFB1>1 000<10

2.7 加标回收

为验证所建立方法的准确度，对玉米样品进行加标回收。在加标回收之前，所有的玉米样品都进行ic-ELISA检测，没有发现FBs。回收率测定结果(表3)表明，本研究所建立的方法回收率为89.36%～108.54%，且变异系数低于5%，说明稳定性良好。这些结果表明，本研究所建立的ic-ELISA检测方法可以应用于玉米样品中FB1、FB2的检测。

表3 加标回收试验Table 3 The recovery of ic-ELISA添加标量/(mg·kg-1)上样质量浓度/(μg·L-1)ic-ELISA回收率/%变异系数/%

3 讨论

本方法最低检测限为 24.5 μg/kg，与我国现行有效的食品中FBs测定方法，包括免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法(17 μg/kg)，高效液相色谱-串联质谱联用法(7 μg/kg)，免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法(17 μg/kg)[19]，出口花生、谷类及其制品中FBs测定方法液相色谱-质谱检测法(20 μg/kg)[20]接近，并且不需要高效液相色谱仪等大型仪器。优于国家规定的粮油中FBs测定方法超高效液相色谱法(50 μg/kg)[21]检测限。满足国家规定的玉米中FBs最大残留限量要求[9]。

本方法对玉米的加标回收率为89.36%～108.54%，优于报道的其他免疫学方法[22-23]。回收率的大小可以评价定量分析的准确度，通常情况下，回收率越高，定量分析结果的准确率就越高[24]。影响加标回收率的因素很多，包括测定方法本身的缺陷、加标量的水平及准确性、加标体积、操作人员水平、样本底值和样品的均匀性等[25]。饶正华等[23]利用免疫亲和层析-荧光度法对饲料中的FB2进行测定，平均回收率为89.22%，蛋白质污染问题使其准确度明显低于ic-ELISA方法。管笛等[22]利用磁微粒酶联免疫吸附法测定玉米中的FB1，回收率在 76.4%～92.0%，该方法虽提高了检测灵敏度，但准确度不及ic-ELISA。

4 结论

本研究建立了对于FB1、FB2的ic-ELISA检测方法，并对条件参数进行了优化，线性检测范围为 1.41～54.2 μg/L，最低检测限为24.5 μg/kg，实测玉米样品加标回收率为89.36%～108.54%。交叉反应结果显示，与伏马毒素FB1和FB2交叉反应率分别为100%和129.88%，与其他真菌毒素交叉反应均小于10%。本检测方法可特异性地检出FB1和FB2。

[1] 王红旗,王俊艳,洪慧杰,等.伏马毒素B1核酸适配体链置换探针的筛选及应用[J].农产品质量与安全,2017(1):44-48.

WANG H Q,WANG J Y,HONG H J,et and application of strand displacement probe for fumonisin B1 aptamer[J].Quality and Safety of Agro-Products,2017(1):44-48.

[2] 黎晓雯, 罗俊崇,张梦丹,等.伏马毒素B1的毒性和检测方法[J].动物医学进展,2019,40(6):112-115.

文章来源：《玉米科学》网址: http://www.ymkxzz.cn/qikandaodu/2021/0119/678.html